细胞凋亡是一种涉及显著形态学变化的生物过程。在早期凋亡阶段，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）会翻转至细胞膜外侧；而在凋亡的中后期，细胞膜的通透性增加，较大分子的化合物如碘化丙啶（PI）能够自由进入细胞并使细胞核呈现红色荧光。

Annexin V / PI检测法原理：Annexin V是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，具有与PS高亲和力的特异性结合能力。正常细胞膜完好，不能让PI穿透，而早期凋亡细胞的膜依然完整，对PI表现出拒染性。但在凋亡后期，细胞膜的完整性受到损伤，使得PI能够透过并染色细胞核。因此，通过同期使用Annexin V和PI，我们可以有效区分早期凋亡细胞与其他细胞的状态。

为了进行Annexin V / PI检测，推荐使用人生就是博-尊龙凯时的流式凋亡检测试剂盒（货号：AC12L033，规格：100T）。以下是操作步骤：

▶ 对照管的设置：

1. 空白管：不添加染料的诱导凋亡细胞，用于电压调节；
2. 单染管：分别添加PI和荧光标记的Annexin V，用于补偿调节；
3. 实验管：诱导凋亡的细胞加入所有实验所需的荧光染料；
4. 阴性管：正常培养细胞添加染料，用于确认细胞正常状态，从而排除假阳性。

▶ 悬浮细胞的收集和染色：

1. 在细胞经历凋亡刺激后，离心5分钟并弃去上清，使用PBS轻轻重悬细胞并计数；
2. 取1~5 × 10^5重悬细胞，离心5分钟，弃上清，加入500µl结合液轻轻重悬细胞；
3. 加入5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀，然后添加5µl碘化丙啶，再次轻轻混匀；
4. 在室温下避光孵育10分钟，可用铝箔包裹以避免光照；
5. 随后立即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC表现为绿色荧光，PI则为红色荧光。

▶ 对于贴壁细胞的收集和染色：

1. 将细胞培养液吸出，使用PBS洗涤贴壁细胞一次，然后用不含EDTA的胰酶消化细胞；
2. 细胞消化后，按照悬浮细胞的操作步骤进行后续处理。

▶ 上机检测：染色孵育完成后，应立即进行流式细胞仪或荧光显微镜的检测。

Annexin V / PI检测法注意事项：

• 在检测贴壁细胞时，建议使用Accutase细胞消化液，以减少对细胞的损伤并保持细胞膜上PS的分布；
• 选择Annexin V的荧光染料时，应考虑细胞的自发荧光，特别是培养时间较长或药物处理的细胞；使用Annexin V-APC可能是更好的选择，以避免药物干扰；
• 染色完成后，请勿固定细胞，应尽快完成检测，必要时可将检测管放置于冰上以减少外界环境对结果的影响；
• 在做凋亡统计时，通常仅统计早期凋亡细胞，后期凋亡的统计意义较小，虽有文献提及总凋亡比例（早期和晚期之和），但单独统计晚期凋亡的意义并不大。

以上操作和注意事项是为了确保实验的准确性和可靠性，选择人生就是博-尊龙凯时的流式凋亡检测试剂盒，将有助于提高研究的质量与效率。