之前的文章《蛋白互作检测之FRET荧光共振能量转移：分子间距离的微妙舞者》和《蛋白互作检测之FRET荧光共振能量转移：分子间距离的微妙舞者（二）》已经详细介绍了FRET技术的基本原理、实验步骤以及实际应用案例。本期，伯小医将引导大家进一步探讨FRET技术中常用的分析方法。

在FRET实验中，FRET效率的精确测定主要受到两个因素的影响：（1）光谱串扰，包括供体荧光在受体通道中的串扰以及在激发供体时受体的直接激发。选择发光谱间隔较大的供体和受体荧光对可以有效降低光谱串扰对结果的影响；（2）参与FRET的供体和受体在荧光基团中的比例。由于自由的供体和受体并非所有分子都会参与相互作用，因此现有的各种方法只能测量表观的FRET效率。

荧光寿命成像

荧光寿命成像（FLIM-FRET）是一种通过测量荧光基团从激发态恢复到基态所需的平均时间（荧光寿命）来分析FRET效率的方法。荧光寿命是一种固有特性，与样品的浓度、吸收、光漂白和激发光强度等无关，但对周围微环境如细胞温度、pH值和离子浓度非常敏感。通过荧光寿命成像，可以灵敏地反映供体和受体之间的能量转移。

FLIM-FRET方法通过测量受体存在和不存在时供体分子的荧光寿命，来确定FRET效率。这种方法具有高时空分辨率和高灵敏度的优势，但FLIM系统价格昂贵，操作需要专业人员，因此推广和应用受到限制。

光谱法

光谱法（sFRET）通过获取供体、受体以及供体-受体样本的发射光谱，再对这些光谱进行拟合分析，从而计算FRET效率。这种方法对FRET效率检测的灵敏度极高，能够检测到低于5%的FRET信号，并有效减少背景光和自发荧光的干扰。

然而，光谱法在数据采集上要求较高，需要进行严格的背景光和自发荧光校正，这增加了实验的复杂性。

受体漂白法

受体漂白法（AP-FRET）利用受体光漂白前后供体荧光强度的变化来计算FRET效率。在FRET存在的情况下，供体荧光强度会因能量传递而降低，而当受体被光漂白后，供体的荧光强度则会增加。这种方法操作简单、对显微镜要求低，因而广泛应用于实际实验中。

然而，活细胞中的荧光漂白恢复及漂白对细胞的损伤使得该方法在细胞内的实时监测中有所局限。

敏化发射法

敏化发射法（SE-FRET）校正供体和受体之间的光谱串扰，以获取FRET图像并计算FRET效率。虽然该方法可以动态监测活细胞中的FRET效率，但需要多组样本进行图像采集，增加了实验工作量。

总的来说，伯小医为大家介绍了四种常用的FRET分析方法。选择合适的方法应考虑具体实验需求及硬件支持。欢迎大家与人生就是博-尊龙凯时进行沟通讨论，共同探讨生物医疗领域的前沿技术和应用。