实验原理

在生物医学研究中，原代细胞培养是一项重要的技术。通过从动物体内提取各种组织，借助酶（如胰蛋白酶）、螯合剂（如EDTA）或机械手段处理，最终将组织分散为单细胞。这些细胞随后被放置于合适的培养基中进行生长、存活与繁殖。随着细胞的繁殖，当培养瓶中细胞形成致密单层并达到基本饱和时，就需要进行传代培养，以促进细胞数量的增加并延续细胞的生命活动。特别是悬浮型细胞可以直接分瓶，而贴壁细胞则需经过消化处理后再进行分瓶。

实验仪器

本实验所需的仪器包括：培养箱（设定为37℃）、培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、以及37℃的水浴箱。

实验试剂

实验中所需的试剂包括：1640培养基或DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、Hank's液、碘酒和75%酒精。

实验步骤

一、原代细胞培养步骤

1. 准备：在净化台上准备好消毒的培养用品，并进行紫外线消毒20分钟。开始工作前洗手，使用75%酒精消毒手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：将组织块放入烧杯中，使用Hank's液漂洗2-3次以清除血污。如怀疑组织可能受污染，可先在含青链霉素的混合液中浸泡30-60分钟。
4. 剪切：使用眼科剪将组织剪成2-3毫米的小块，以便于消化。加入比组织块体积多30-50倍的胰蛋白酶液，倒入三角烧瓶中并封口。
5. 消化：消化可在恒温水浴或37℃温箱中进行，每20分钟轻摇一次。如果使用电磁搅拌器会更好。消化时间视组织块大小及硬度而定。
6. 分离：消化液显混浊时，用吸管取出少量观察，如已分散为细胞团或单个细胞，立即终止消化，通过不锈钢筛滤去未完全消化的组织块。以低速（500-1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含血清的培养液。
7. 计数：使用计数板进行细胞计数，若细胞密度过高可加入培养液调整后，将细胞分装入培养瓶。大多数细胞对于pH的要求在7.2-7.4之间，培养液呈微红色，如颜色偏黄则表明液体变酸，可使用NaHCO3进行调整。
8. 培养：将培养瓶放置于37℃培养箱中，如使用CO2温箱，则需用纱布或螺旋帽封闭瓶口。每次换液时要更换新的瓶塞，以防霉菌滋生。

二、原代组织块培养法

1. 剪切：将组织小块放入小烧杯或青霉素小瓶中，用Hank's液漂洗几次去除表面血污，然后用眼科剪将其剪成1毫米小块。
2. 摆布：用弯头吸管吸取小块，放入培养瓶中，并将小块均匀摆放在瓶底，尽量保持间距为0.5cm，每25ml培养瓶底可摆放20-30块。
3. 翻转培养瓶，瓶底朝上，轻轻注入培养液少许，保持让小块微干缺水，然后再反转培养瓶，让培养液覆盖组织小块。
4. 培养：当细胞自组织块中游出并数量增多后，补加培养液。

三、贴壁细胞传代的操作步骤

1. 吸除培养瓶内旧培养液。
2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液，覆盖瓶底即可。
3. 置于温箱中2-5分钟，观察细胞质回缩和细胞间隙增大的现象，随即终止消化。
4. 吸除消化液，加入一定量的Hank's液，轻轻转动培养瓶冲洗残留消化液，动作要轻以避免已经松动的细胞流失。如果单用胰蛋白酶消化，吸除后可直接加入培养液。
5. 轻轻用吸管吹打瓶壁，使细胞从瓶壁脱离形成细胞悬液。
6. 计数后将细胞悬液分装入多个培养瓶内，放入温箱进行培养。

四、悬浮型细胞传代

1. 吸出细胞培养液，转入离心管，离心于1000rpm，5分钟。
2. 吸掉上清液，加入新鲜培养基，均匀混合后转移至新的培养瓶中，保持正常培养条件。

注意事项

1. 操作前请先洗手，进入超净台后使用75%酒精或0.2%新洁尔灭进行擦拭。试剂瓶口也需擦拭。
2. 点燃酒精灯，尽量在火焰附近进行操作，耐热物品需经常在火焰上烧灼。金属器械烧灼时间勿过长，以避免退火，待冷却后再进行组织的取用。
3. 操作应准确迅速，但要避免过快以引起空气流动，增加污染风险。
4. 不要用手触碰已消毒器皿的接触面，并合理布局工作台上的材料。
5. 瓶子开口后务必保持45°倾斜位。
6. 吸溶液的吸管等应避免混用。

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